检测五种致泻性大肠埃希氏菌

检测五种致泻性大肠埃希氏菌

随着经济全球化的到来,食品安全问题在社会经济中的重要性尤为突出,我国发生的食物中毒事件中,细菌性食物中毒的人数最多,占总中毒人数的42.8％,其中致泻性大肠埃希氏菌是引起人体以腹泻症状为主的全球性疾病的常见病原菌,在我国引起感染性腹泻的发病率居所有传染病之首,国际上分类主要包括五类,即肠致病性大肠埃希氏菌(EPEC)、肠产肠毒素大肠埃希氏菌(ETEC)、肠侵袭性大肠埃希氏菌(EIEC)、肠出血性大肠埃希氏菌(EHEC)和粘附性肠埃希氏菌(EAEC),因此快速准确地检测这五种病原菌对预防和控制由其引起食物中毒事件有着十分重要的作用.

1.试剂配制（试剂准备区）

从试剂盒中取出PCR反应液在室温融化，将PCR反应液充分震荡混匀，所有试剂在使用前2000rpm离心10s。设所需要的管数n（n=样本数+1管阴性对照品），每个测试反应体系试剂配置如下表。计算所需要的n管反应的各试剂的使用量，加入至适当体积的无菌离心管中，充分混合均匀，分装至无菌PCR反应管中，每管24μl。

2.PCR扩增（扩增和产物分析区）

将样本、阴性对照品使用前恢复至室温，2000rpm离心10s。向每个PCR反应管中分别加入样本、阴性对照品各1μl，震荡混匀，于2000rpm离心10s。将PCR管放入PCR仪中，使用以下程序进行扩增反应，整个扩增反应约需2小时

3.结果判断（扩增和产物分析区）

从PCR管中取出2μl PCR产物与9μl阳性对照品一起进行浓度为2%的琼脂糖凝胶电泳检测，在紫外灯下阳性对照品从上至下应有11条带，分别为1487bp、1111bp、910bp、766bp、655bp、544bp、400bp、324bp、244bp、171bp和102bp。

样品观察到1487bp、910bp、544bp条带即为毒力基因uidA、bfpB和escV阳性，即为典型EPEC菌株。

观察到1487bp、544bp、324bp、244bp条带即为毒力基因uidA、escV、stx2A和stx1A阳性，即为典型的EHEC菌株。

观察到1487bp、655bp和171bp条带即为毒力基因uidA、elt和estlb阳性，即为典型的ETEC菌株。

观察到1487bp和766bp条带即为毒力基因uidA和invE阳性，即为典型的EIEC菌株。

观察到1487bp、1111bp、400bp和102bp条带即为毒力基因uidA、pic、aggR和astA阳性，即为典型的EAEC菌株。

阴性对照品结果应为阴性。